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胚胎植入前遗传学筛查技术与方法

胚胎植入前遗传学筛查技术与方法

胚胎植入前遗传学筛查技术与方法,对移植前胚胎进行PGD胚胎植入前遗传学筛查的目的在于:①明确遗传学诊断。②确定所研究基因的来源及遗传方式。③胚胎植入前遗传学筛查提供所研究基因的多样性和表达方式。

1.取活检类型

(1)极体活检:第一极体产生于卵子第一次减数分裂时,胚胎植入前遗传学筛查可以在取卵24h内对其进行分析,由于极体包含了与相关卵子互补的基因型,通过分析极体就可以确定卵子的基因型,这种类型的分析胚胎本身没有进行显微操作,且在种植窗口内获得了更多的分析时间。对第一、第二极体的连续性分析可对来自母亲的染色体异常做出准确的分析。这项技术的缺点是它不能用于男性中常染色体显性遗传患者和X-性连锁遗传病的检测诊断。

(2)卵裂球活检;大多数生殖中心进行单基因疾病PGD时采用对分裂期胚胎进行卵裂球活检,女方经超排卵取卵后,经过传统的IVF过程或ICSI过程受精,然后在体外培养至第3d,胚胎达到6~8细胞期,对每个胚胎取1-2个细胞分析,在分析的同时,活检后的胚胎继续培养,确诊后将2?3个正常胚胎放入子宫。

卵裂球活检的主要缺点在于只有1-2个细胞被用于遗传学分析,它并不能代表整个胚胎。

(3)囊胚活检:胚胎在体外培养至受精后5-6d,达到囊胚期时可提供更多的细胞用于分析,胚胎在这个时期分化为滋养外胚层和内细胞团,对滋养外胚层的活检不会伤及内细胞团。因此理论上的最佳活检时期是囊胚期。但不幸的是,即使给予最佳的培养条件后,只有50%左右的正常胚胎在体外发育到囊胚期。

2.活检方法

胚胎植入前遗传学筛查目前多采用机械切割或Tyrde酸消化后,用平口针吸出细胞的方法,近期也有釆用激光打洞后取活检的方法,认为这种方法更安全、有效,对胚胎的远期影响最小。


胚胎植入前遗传学诊断检测手段

胚胎植入前遗传学诊断检测手段(DPCR技术(聚合酶链反应技术):它能在体外将包含引起疾病的突变基因的DNA扩增,通过应用特定的底物,DNA聚合酶,经过变性、退火的重复过程,DNA序列扩增万倍,这样就能检测出单个细胞内DNA±某个碱基的改变。这个扩增过程可以在几小时内完成。该方法快速灵敏,但问题在于单一序列的扩增可能导致扩增失败,对男性卵裂球Y序列的PCR扩增失败可能达到15%。另外,显微操作过程中DNA的污染也会造成误诊的可能。一种新的胚胎植入前遗传学诊断方法荧光PCR技术有望提高其确诊率。

(2)荧光原位杂交技术(flurescenceinsituhybridizatin,

FISH):主要用于染色体结构及数目异常的检测,它是将单个细胞的核在显微镜载物片上展开,用经荧光色素标记的染色体特异探针与这些核进行原位杂交,每条被检测的染色体由于荧光素的作用而显示不同的颜色。该方法快速、灵敏,但也存在因杂交失败或杂交信号过弱而误诊的可能。

胚胎植入前遗传学诊断在进行染色体分析时,FISH较PCR优越,特别是在性别检测时,FISH可同时检测X和Y染色体,因此不仅可以检测胚胎的性别,还可检出性染色体的非整倍性畸变。当已知父母为平衡易位携带者时,双色FISH可诊断胚胎的染色体是否存在不平衡易位,PCR技术一般用于单基因缺陷疾病如囊性纤维变的诊断。PCR技术与FISH结合分析同一细胞,可以使检出率达到90%-95%。

四、PGD存在的问题及发展前景

(DPGD虽然可以提高某些患者的妊娠成功率,但它在总体上每周期的妊娠成功率仅达到20%。它在理论上提高了产前诊断的质量,因为它是对种植前胚胎的检测,但其可能造成误诊.因此大多数中心建议和要求妊娠后再进行产前诊断。PGD过程对胚胎进行显微操作必然引起胚胎所处环境波动,活检更是一种创伤性操作,虽一般不会影响其发育潜能,但易使胚胎发育延迟。

(2)大多数中心都进行PGD检测胚胎的性别,胚胎植入前遗传学诊断目前对于X连锁隐性遗传病的检测是通过检测活检细胞DNA确定胚胎的性别来实现的,而不能检测确切的突变基因。该技术同样可用于非基因缺陷者,如非医学原因的性别选择,对社会家庭将造成巨大的影响。

(3)随着PGD的发展,对多基因疾病的移植前诊断成为可能,如糖尿病、冠状动脉性心脏病、恶性肿瘤等疾病易患性的基因因素的研究,对这类胚胎的筛选将引起大量问题。


促排卵技术及卵泡期监测

促排卵技术及卵泡期监测,在实施IVF-ET等助孕技术的过程中,提高妊娠率的首要问题是促排卵方案的选择。目前,全世界广泛采用了超排卵方法,其目的在于增强与改善现存卵巢功能,达到不受自然周期所限制,获取多个健康卵子,提供受精后胚胎移植。

一、超排卵

超排卵方案应根据患者的年龄、病因和以往治疗的反应决定超排卵方案,如年轻人和PCS患者容易发生卵巢过度剌激综合征,故促性腺激素的剂量应偏低,而以往反应较差者剂量宜加大。促排卵目前常用的方案有CC,HMG,FSH,CC+HMG或FSH以及GnRHa+HMG或FSH。

1.单纯氯米芬

氯米芬主要作用于下丘脑、垂体与雌激素竞争占领受体,阻断雌激素所产生的负反馈效应以达到促性腺激素分泌增加。月经第3d或第5d开始口服氯米芬100mg共5d。氯米芬的优点是价廉,卵巢过度刺激综合征的发生率低,监测要求不严,缺点是获卵少,血中和卵泡液中E2水平低,内源性LH峰发生率高,氯米芬的抗雌激素作用可影响子宫内膜的正常功能而干扰着床,此外,有22%的周期因卵巢反应差而取消。

2.克罗米酚和HMG

同时或序贯用药,如第3~7d用CC100mg/d,第5d开始HMG2~4支/d肌内注射,2?3d后根据B超检査决定HMG用量,当优势卵泡直径218mm时停HMG,在最后一针HMG后36h注射HCG。

3.单**MG

月经第3d开始用HMG3支/d.PCS患者酌情减量,2~3d后根据B超监测的结果决定HMG的用量和持续时间。当优势卵泡>16mm,Ez浓度每天加倍,LH峰出现时,注射HCG的时间缩短为28-30h后。该促排卵方案比氯米芬妊娠率高,流产率低。

4.单纯FSH

FSH主要对卵泡早期募集的启动起作用,过去认为LH对雌激素生成及改善卵子质量是必需的,但目前已证明单独使用纯FSH在卵泡期也能达到目的。FSH用于对HMG治疗周期反应不满意者如多囊卵巢综合征可有改善作用。适用于一些年龄稍大基础FSH水平较高或过去使用FSH/HMG反应欠佳者。其用法同HMG。

5.FSH/HMG

使用此方案认为合乎正常周期Gn分泌顺序的治疗方法。对以往反应不好者于月经第3d加用FSH2支/d,接着使用HMG可增加获卵数和妊娠率。

6.GnRHa/FSH/HMG

已广泛应用于IVF中,并已取得满意效果。GnRHa对GnRH受体有高度亲和力,形成具有生物活性的激素受体复合物,刺激垂体Gn急剧释放(flareup)。由于激素复合物能产生对抗蛋白酶降解作用,从而延长了半衰期。若GnRHa肆续应用,垂体细胞表面可结合GnRH受体减少,对GnRHa刺激不敏感,即所谓降调节作用,使Gn分泌处于低水平,但这种去垂体状态可停药而恢复。根据GnRHa的生物学作用特点,应用于IVF中有长方案、短方案和超短方案之分。长方案是从上一周期的21d或23d开始应用GnRHa直到注射HCG时,GnRHa起完全降调节作用。短方案是从治疗周期第Id开始应用GnRHa直至注射HCG时,利用了GnRHa的“flareup”作用,随后抑制了内源性的LH峰。超短方案是从治疗周期第3d开始用GnRHa,仅用几天,主要利用其“flareup”作用。

GnRHa应用于IVF的超排卵中具有以下优点:①防止卵泡过早黄素化;②长方案可改善卵泡生长发育的同步化;③增加高质量卵子提高妊娠率;④改善子宫内膜种植环境。但具有以下缺点:①增加使用Gn的用药量及延长用药时间;②黄体功能不全;③卵巢囊肿;④卵巢过度刺激征。


卵泡监测怎么做

卵泡监测怎么做?卵泡监测的目的是观察卵巢对促性腺激素治疗的反应,以决定FSH/HMG用量,注射HCG的时间,以及是否取消该周期。目前普遍使用B超和测定血中E2水平来检测卵巢的反应。

1.B超检测

从月经的第6-8d开始B超检测,卵泡监测根据卵泡生长的速度每天或隔天测量卵泡的直径和子宫内膜的厚度与形态,优势卵泡平均每天生长1.5-3.0mm,当卵泡发育成熟时内膜的厚度应达8mm以上,如<6mm则妊娠率低,内膜的形态若呈三线征则表示内膜发育良好。

2.EZ水平的变化

卵泡监测当用HMG后E,水平一直上升,而用HCG后&水平也上升者,说明卵泡发育良好,卵细胞质量高。若用HMG后E2水平无上升趋势,说明卵巢对刺激的反应差,应取消该周期。若玖水平>3500pg/mL,则有可能发生严重卵巢过度刺激征。

3.尿LH峰的测定

由于注射HCG的时间十分重要,如未用GnRHa,注射HCG前应测血或尿LH峰,如已出现内源性LH峰,应放弃采卵。

4.注射HCG的标准

卵泡内卵母细胞的最后成熟需要LH的刺激,注射HCG的时间非常关键,过早可促使卵泡闭锁或过早黄素化,卵母细胞不成熟,过晚则已排卵,卵母细胞丢失,当最大的卵泡直径达18mm,另外至少3~4个卵泡直径>14mm,子宫内膜厚度>8mm时,可肌内注射HCG5000~10000U。


试管婴儿冻胚移植

试管婴儿冻胚移植,大约在200年前,人类开始尝试对组织细胞进行冷冻保存,但直到1940年,人们成功地应用甘油做保护剂将精子存于-80°C,才使冻存技术的研究获得了突破性进展。随后,随着其他保护剂二甲基亚枫(DMS)、丙二醇的应用,冻存技术被广泛地应用于人类助孕技术领域。1983年,Trunsn等首次报道了冻融人类胚胎移植获得妊娠成功,1986年,Testart等人成功地将冻融人类早期胚胎扩大到冻融人类合子,并成为目前冷冻人类胚胎的最普遍的方法。然而,冷冻保存未受精的人类卵子仍面临技术方面的困难。可替代的方法是冻融卵巢组织后再移植,为人们保存生育力提供了新的希望。那么现在试管婴儿冻胚移植技术怎么样?

一、冻融技术的原理及关键步依

试管婴儿冻胚移植尽管不同组织、细胞对冷冻的敏感性存在显著差异,但它们冻存的基本原理是相同的。

(一)控制冷冻时细胞脱水的速率

在冻融过程中造成细胞损伤的主要原因是胞内冰晶的形成。因此,在冷冻保存过程中,最重要的是减少细胞内水分的含量,去除大量的水分,然而过度的脱水也是有害的。过度脱水造成溶质浓度的升高,渗透压也加大,液体中溶质渗透压过高会在冷冻过程中损伤细胞。因此既要在冷冻过程中从细胞内移去足够的水分,尽可能减少胞内冰晶形成,又要调整溶质的渗透压使其造成的有害影响最小。

(二)植冰

植冰是在略低于水溶液的正常冰点的温度下诱导冰晶形成,以防止超冷现象的出现,阻止核冰晶的自动形成。这是胚胎存活所必需的。植冰可在-5—7°C人工诱导或经程序冷冻仪控制形成。这样能尽量减少由于轻微的冷却速率的变化引起结晶时潜在热量释放对细胞造成的有害影响。

(三)复苏

复苏过程是整个冷冻操作过程的逆转。这个过程的基本目的有两点:①细胞再水合;②移去渗透到细胞内的冷冻保护剂。

融解后的胚胎一般表现为立刻收缩得很小,这表明在冷冻后的缩小的细胞内,由于透过的冷冻保护剂的浓度高,很少发生再水合。因此,细胞的再水合与细胞内冷冻保护剂的渗出通常是一个结合的过程。复苏过程中细胞内冷冻保护剂移出的速率对细胞今后的存活起着决定作用。水的快速流入会导致胚胎肿胀和裂解(称渗透性休克),避免发生这种渗透性休克的方法是将胚胎逐步移入含有较低浓度冷冻保护剂的液体中使冷冻保护剂逐步移出,在每一次移动时,细胞的体积都长到最大,以达到等渗平衡。

人类胚胎的冷冻保存

试管婴儿冻胚移植,冷冻技术的发展使体外受精胚胎移植工作取得较大进步。冻存胚胎的价值很大,因为它没有重复的花费和长期的激素治疗,而使患者获得额外的胚胎移植,增加了单次取卵周期的总体妊娠率。

(―)分裂期胚胎冷冻

大多数生殖中心选择在分裂期评价胚胎的质量后再决定冻存哪些胚胎。冻存胚胎的保护剂一般选用DMS或丙二醇,由于胚胎质量与冻存方法的不同,17%-70%的人类胚胎经冻存后不能存活,且其临床妊娠率低于非冷冻胚胎,这样就使人们不得不考虑冻存胚胎的效率。

(二)原核期胚胎冷冻

慢速冷冻方法的成功应用使原核期胚胎冷冻取得极大成功,丙二醇是目前冻融原核期胚胎最常用的冷冻保护剂,较高的胚胎存活率与妊娠率使原核期胚胎的冷冻保存最大限度地提高了单次取卵的妊娠成功率。




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